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    3. 進行m6A熱點研究,先Get這『3大研究區域、2大報告系統』

      來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2020-12-1   訪問量:1061評論(0)

      N6-methyladenosine(m6A)是哺乳動物mRNA中最豐富的內部修飾,轉錄本上的m6A參與眾多分子機制,如mRNA前剪接,核轉運,穩定性,翻譯和microRNA生物發生,并且與疾病的發生密切相關。根據m6A位于mRNA的位置,可以借助“雙熒光素酶報告系統”(驗證UTR區域時使用;借助螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶研究調控活性)以及“miniGene報告系統”(驗證外顯子、內含子m6A使用;見歷史原文研究可變剪切的發生)進行研究。那么,m6A如何根據其位置,選擇對應的報告系統,通過實驗設計驗證其功能呢?

      m6A修飾主要發生在RRACH基序的腺嘌呤上,由“編碼器Writer”、“消碼器Eraser”配合“讀碼器Reader”完成修飾、解碼過程。涉及的相關基因及基本功能如下1

      m6A的鑒定方法有m6A Seq、MeRIP-Seq、m6A-LAIC-seq、PA-m6A等方式,具體見《A Review in Research Progress Concerning m6A Methylation and Immunoregulation》。

      做m6A的第一步是鑒定功能性的相關基因,如對四種癌細胞MeRIP-Seq得出與正常細胞,差異表達的兩組基因2

      D. m6A修飾上調的基因; E. m6A修飾下調的基因

      根據早先報道的文獻,差異基因中,CDCP1屬于癌基因。進一步驗證CDCP1-m6A的修飾情況:

      A. 癌細胞CDCP1的m6A明顯升高;
      B-C.正常細胞與癌細胞的CDCP1水平無明顯變化;
      D-F.癌細胞CDCP1蛋白表達增強,且與METTL3的催化正相關

      鑒定出的基因根據其m6A修飾位置,采取不同方式構建報告系統,并驗證其對應功能即可(下面簡敘3UTR-m6A研究路徑,其余位置只突出報告系統部分)。

      一、3UTR-m6A研究方式

      m6A在3'非翻譯區(UTR)特別豐富,也是目前常做的類型,主要是影響蛋白表達(接上文):

      CDCP1在3UTR上含有多個m6A修飾位點,通過構建雙熒光素酶報告系統,構建全長、截斷型、突變型,與催化蛋白METTL3野生型、突變型共轉,逐一驗證修飾位點與基因表達的關系,最終確認,3UTR的三個m6A修飾共同促進CDCP1的上調表達2

      A.構建CDCP1-3utr三個m6A位點野生型、突變型(A突變為T)報告系統;B.報告載體與野生型以及催化突變體METTL3共轉測定相對熒光素活性

      作者進一步測試了讀碼器YTHDFs是否結合CDCP1-mRNA,RNA免疫沉淀分析表明,YTHDF1,而不是YTHDF2或YTHDF3與CDCP1 mRNA結合,得出METTL3 / YTHDF1識別CDCP1 3'-UTR上的m6A殘基:

      A-C. CDCP1的RNA免疫沉淀驗證

      在已經驗證出腫瘤細胞中CDCP1的上調與METTL3 / YTHDF1修飾有關,剩余的實驗則基于甲基化修飾相關基因以及目標蛋白在細胞以及動物水平進行KO或者過表達進行驗證即可:
      E.敲除METTL3,CDCP1抑制細胞遷移和侵襲;F-G.CDCP1過表達部分挽救了METTL3耗竭引發的細胞遷移和侵襲;H-J.METTL3敲除抑制了腫瘤生長;K.免疫染色

      同樣,消碼器也是采取上述方法驗證:m6A脫甲基酶FTO的下調與透明細胞癌發生相關,FTO的下調導致了PGC-1α下調,影響了線粒體的功能。通過構建3UTR的全長野生型及m6A突變型(文章A突變為C)報告系統,與FTO過表達共轉,驗證出FTO作用于PGC-1α的3UTR,促進表達3
      B,構建PGC-1α-3UTR野生型、突變型報告系統,與FTO及對照共轉染;C,FTO特異性增強了野生型的表達

      二、5UTR-m6A研究方式

      發生于5UTR的m6A可以促進了不依賴帽的翻譯起始,增強蛋白表達。文章通過合成5UTR未修飾、m6A修飾、非m6A甲基化的的熒光素酶RNA全長,轉染293,結果只有m6A修飾的發生翻譯4:

      5UTR報告系統構建及結果驗證(2’-O-MeA為對照)
      三、pre-mRNA-m6A研究方式

      m6A修飾在pre-mRNA中的分子機制,則依靠反式作用因子影響剪切的發生:

      為了驗證參與剪切的蛋白,通過串聯親和純化SFB-YTHDC1獲取到了多個互作蛋白SRSF1,SRSF3,SRSF7,SRSF9和SRSF10,并進一步驗證得出了下面的互作功能模型,YTHDC1/SRSF3復合物傾向于外顯子保留,而SRSF10促進外顯子剪切去除5
      外顯子中的m6A修飾引發的可變剪切

      通過構建miniGene報告系統,將ZNF638外顯子2克隆到pSpliceExpress載體5,分別構建YTHDC1、SRSF3、SRSF10結合位點的突變型,驗證可變剪切機制:
      D.構建示意圖以及猜測的外顯子剪切情況;F,YTHDC1、SRSF3的突變都導致了外顯子2的去除,SRSF10的突變導致了外顯子2的保留增加


      同樣,內含子也含有m6A修飾:果蠅基因SXL內含子中m6A的修飾與否決定了性別,m6A的修飾產生了一個外顯子的可變剪切,雌性內含子含有m6A修飾,缺失了外顯子;而雄性不含m6A,保留了一個外顯子,該機制同樣可以基于上述的miniGene報告系統研究6
      果蠅Sxl內含子修飾引發的可變剪切

      表觀遺傳學已成為時下科研熱門研究方向,本文重點論述了mRNA不同位置的功能特征以及研究方法。當然,讀碼器的不同,具體的機制也是有差異的。吉凱基因提供meRIP-seq測序、報告系統驗證一站式服務,還在等什么,快來咨詢吧。!
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      【參考文獻】
      1.m6A modification in RNA: biogenesis, functions and roles in gliomas
      2.Dynamic m6A mRNA methylation reveals the role of METTL3-m6A-CDCP1 signaling axis in chemical carcinogenesis:
      3. N6‐methyladenosine demethylase FTO suppresses clear cell renal cell carcinoma through a novel FTO‐PGC‐1α signaling axis
      4. Dynamic m6A mRNA methylation directs translational control of heat shock response
      5. Nuclear m6A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing
      6. m6A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination



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